核黄素（维生素B2）荧光光度定量测定法

 一、目的

       1.了解荧光法测定核黄素的原理和方法

       2.学习荧光光度计的操作和使用

       3.掌握荧光定量分析工作曲线

二、原理

       核黄素（维生素B2)是一种异咯嗪衍生物，其水及乙醇的中性溶液为黄色，并且有很强的荧光，这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐还原成无色的二氢化物，同时失去荧光，因而样品的荧光背景可以被测定。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，

三、实验器材

       1.核黄素片（5mg/片）

       2.荧光光度计

       3.容量瓶100ml（*2）

       4.试管1.5cm*15cm（*7）

       5.吸管10.0ml（*1），5.0ml（*1），2.0ml（*1），0.50ml（*2）

       6.量筒1000ml（*1），100ml（*1）

四、实验试剂

       1．核黄素标准溶液：准确称取核黄素10mg，放入预先装有约50ml蒸馏水的1000ml容量瓶中，加入 5ml 6mol/ L 乙酸，再加入大约800ml水，置水浴中避光加热直至溶解，冷却至室温，用蒸馏水定容至1000ml，混匀。

       2．连二亚硫酸钠（保险粉）或亚硫酸钠。

       3.  36％乙酸。

五、操作

    1．标准曲线绘制

       将配好的10ug/ ml 标准核黄素溶液，按表50所示比例稀释成六个标准溶液。

    2．样品溶液的配制

       将被测的样品（如核黄素药片、维生素 B 针剂等）参照标准溶液的含量范围和溶剂体系配制成测定溶液。对于食物和生物材料中的核黄素测定，一定需要事先经过抽提，或经过分离，纯化处理。

    3．荧光测定

       参照附录六中荧光光度计的使用说明，选用滤色片，核黄素荧光测定的激发光波长为460nm，发射光波长为520nm。因此可选用带迪型400nm（蓝色）滤色片为激发光滤色片，选用截止型510nm（红色）滤色片为发射光滤色片。待仪器预热并调好零点后，用0号标准溶液（2.5ug/ ml ）作为参比溶液调荧光光度计的荧光强度读数到满刻度（100%)，分别测定其他标准溶液和样品溶液的相对荧光强度，在测定中如果样品溶液的荧光强度超出100％则需要再行稀释，在每一个测定溶液测定完后，需要重新倒回到相应的试管内。

    4,  数据处理

       每一个测定溶液的荧光强度读数矫正公式为：F=F1+F2

       式中 F：校正后的荧光强度；

               F1：未还原时测得的荧光强度：

               F2：还原后测得的荧光强度。

       以标准溶液校正后的荧光强度为纵坐标，相应的含量为横坐标，作出核黄素测定的标准曲线。将样品溶液校正后的荧光强度在工作曲线上查出相应的含量。

六、注意事项

       在所有操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。