铜锌超氧化物歧化酶（SOD）纯度测定-酶活力测定

         超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，简称SOD ,EC  1.15.1.1）广泛存在于动物、植物及藻类等生物体内，它的功能是催化超氧阴离子自由基歧化为过氧化氢和氧：

                                                                               2O- 2+2H+SOD →H2O2 +O2

        产生的过氧化氢在生物体内易被过氧化氢酶所分解。超氧自由基是生物体内正常代谢的产物，但自由基的积累将使细胞膜的脂质发生过氧化作用而引起膜裂变，导致细胞膜损伤甚至细胞死亡。SOD是生物体内一种重要的自由基清除剂，目前人们已开始研究它在治疗放射病以及抗炎症和抗衰老等方面的临床应用。

       按照 SOD 活性中心所含的金属离子不同可分为 Cu · Zn - SOD , Mn - SOD 和 Fe -SOD3种。 Cu · Zn - SOD 存在于动、植物的细胞质和植物的叶绿体以及某些原核生物中，对氰化钾敏感； Mn－SOD存在于真核生物的线粒体和许多原核生物中，其活性不被1mmol/ L 氰化钾抑制，但对氯仿-乙醇敏感； Fe - SOD 则主要在需氧的原核生物中存在。

       Cu - Zn - SODM，为31000~33000，一般由两个亚基组成，每个亚基由约150个氨基酸残基组成，并含1个 Cu2+和1个Zn2+。酶分子中锌离子主要起稳定结构的作用，铜离子则与酶活性直接相关。 Cu · Zn - SOD 固体或溶液呈蓝绿色，在258nm处有最大光吸收。它是一种保守性强，对环境PH和温度适应范围广的酶。

       电泳谱活性染色采用氮蓝四唑（nitroblue tetrazolium，简称NBT )﹣核黄素光化还原法。核黄素在可氧化物质，如四甲基乙二胺（ TEMED ）存在下被光化还原。在空气中重氧化时被还原的核黄素将产生超氧阴离子自由基，随后此超氧阴离子自由基又还原无色的 NBT 成不溶性蓝甲臜（blue formazan )。SOD由于能清除超氧阴离子自由基，将抑制蓝甲臜的形成。凝胶板染色后成为蓝色背景，SOD活性谱带将呈透明的亮区。

       SOD 活力的测定方法有很多种，其中以化学法应用最为普遍。化学测定法包括两个方面：一是产生超氧自由基，如黄嘌呤氧化酶起作用时会产生超氧阴离子自由基，肾上腺素自氧化和邻苯三酚在碱性条件下自氧化都能产生超氧阴离子自由基；另一是对超氧阴离子自由基的检测，多数是利用反应液中能与超氧阴离子自由基起作用，并易于被检测的指示物质的浓度变化来测定 SOD 活性。常用的测定方法有：黄嘌呤﹣黄嘌呤氧化酶﹣细胞色素c法；氮蓝四唑﹣核黄素法和邻苯三酚法。

       本实验采用邻苯三酚（pyrogallol）法测定酶活力。邻苯三酚自氧化反应中产生的超氧阴离子自由基，进而形成带色的中间物。在420nm处有最大光吸收（A最大），在反应的最初4~5分钟内中间物的积累与时间成线性关系。在 SOD 存在下，由于它能催化超氧阴离子自由基与H+生成H2O2和O2，因而抑制了此中间物的积累。通过测定邻苯三酚的自氧化反应速度（ΔA420nm/ min）和 SOD 抑制下的自氧化速度(ΔA420nm/ min )，便可算出 SOD 活力。通常规定在一定条件下1mL 反应液中抑制邻苯三酚自氧化速度的50％的酶量为一个酶活力单位。单位体积中的酶活力（单位／mL ）可按下式计算：

SOD活力（单位/ml）=ΔA420nm/ min-ΔA‘420nm/ minΔA420nm/ min×100%50%

×反应总体积（ml）×酶样液稀释倍数酶样液体积（ml）

       酶活力测定

       1.酶活力测定试剂

           缓冲液：100mmol/ L .pH8.20 Tris﹣二甲胂酸钠缓冲液（含2mmoI/ L二乙撑三胺五乙酸）。此处二乙撑三胺五乙酸用作鳌合剂，它能有效防止Fe2+，Cu2+和Mn2+的干扰，因为即使微量的铁也能加速邻苯三酚的自氧化作用。

           邻苯三酚溶液：浓度为6mmol/ L ，用10mmol/ L 盐酸配制。

       2.酶活力测定步骤

          （1）邻苯三酚自氧化反应速度的测定：测定实验在25℃下进行。按下面酶活力测定加样表中的顺序和用量向1cm 厚度的比色池中加入预温至25℃的缓冲液、重蒸水和邻苯三酚（以10mmol/ L 盐酸代替邻苯三酚作为测定对照），加入邻苯三酚后立即启动秒表计时，于420nm处每隔30秒测定1次光吸收，共测10个数据。以光吸收值对时间作图，根据线性变化部分的斜率求出自氧化反应速度（ΔA420nm/ min )。适当改变邻苯三酚的用量，使自氧化反应速度为0.02/min。

          （2）酶抑制下自氧化反应速度的测定：测定过程与测定邻苯三酚自氧化反应速度相同，只是在此反应系统中加入待测的SOD样液（约1个酶活单位）。适当增减样液的稀释度或用量，使抑制下的自氧化反应速度（ΔA420nm/ min )为0.007~0.013/min，也即只能抑制自氧化反应的35%~65%（超出此范围，抑制自氧化的程度与酶量不成比例）。

       3.酶活力的计算

          本实验条件下，单位体积中的酶活力按下式计算：

SOD活力（单位/min）=0.02/min-ΔA‘420nm/ min0.02/ min×100%50%

×3（ml）×酶样液稀释倍数酶样液体积（ml）

4. 蛋白质含量的测定：采用Bradford法（考马斯亮蓝染色法）。（BOXBIO/AKPR015）

         酶纯度鉴定

           分离纯化所得制品（包括粗酶和纯品）的纯度采用PAGE和活性染色进行鉴定。

         1.电泳：PAGE采用不连续系统进行。分离胶：浓度为10%，缓冲液为37.5mmol/L，pH8.8Tris-HCL（含0.03%TEMED )；浓缩胶：浓度为3%，缓冲液为62.5mmol/L，pH6.8 Tris-HCL（含0.06%TEMED )；电极缓冲液为5mmol/L  ,pH8.5 Tris -38.4mmol/L甘氨酸；样品溶液为50mmol/L，PH7.5Tris-HCL（含10%甘油，0.02%溴酚蓝）缓冲液，上样量约10ug蛋白。电流：样品进入分离胶前10mA，进入分离胶后20mA。电泳谱蛋白染色用0.05％考马斯亮蓝 R -250（含20%水杨酸）溶液。

         2.活性染色：电泳后切下需要活性染色的凝胶板，浸入含0.20% NBT -0.01％核黄素溶液（避光冷处保存可反复使用多次）于暗处放置20分钟，取出，以白纸为衬底，置日光或日光灯下照射（20~30分钟）直至蓝色背景上出现清晰的活性亮斑，最小检出量约2ng。显色板浸入水中以除去多余的试剂，与蛋白染色的胶板并置拍照，以便比较，

       上述活性染色方法可用于动、植物组织的SOD同工酶谱（包括电荷异构体）分析。利用Cu·Zn - SOD 和 Mn - SOD 对氰化钾和氯仿﹣乙醇的敏感性不同，可以鉴定样品谱带所含的SOD种类。电泳样品液中加入氰化钾（终浓度为20mmol/ L ) Cu · Zn - SOD 活性即被抑制；样品液加入0.5倍体积的氯仿﹣乙醇（5:3, V /V ）摇匀，于冰浴放置10分钟，离心，收集上清，取样进行电泳，此时样品中的 Mn - SOD 活性将被抑制。

       试剂和器材

       试剂

       1.2.5%草酸钾溶液

       2.0.9%氯化钠溶液（生理盐水）

       3.氯仿-乙醇混合液（5：3，V/V）

       4.K2HPO4·3H2O（化学纯）

       5.丙酮

       6.20mmol/L，PH7.5Tris-乙酸缓冲液

       7.50mmol/L，PH5.0Tris-乙酸缓冲液（含0.2mol/L氯化钠和含0.3mol/L氯化钠两种浓度）

       8.DEAE-纤维素（DE-52）

       9.Sephacryl HR S-200或Sephadex G-100

       10.0.5mol/L

       11.100mmol/L，PH8.20 Tris-二甲胂酸钠缓冲液（含2mmol/L二乙撑三胺五乙酸）

       12.6mmol/ L 邻苯三酚溶液（用10mmol/ L 盐酸配制），配制前最好经升华纯化。溶液可在4℃下存放数周。

       13.考马斯亮蓝染色液（用于 Bradford 法定量蛋白质）:100mg考马斯亮蓝 G-250溶于50mL95％乙醇，加入85％磷酸100mL，加水稀释至1000mL。

       14.结晶牛血清清蛋白（作定量标准物）

       15.30％丙烯酰胺﹣0.8％亚甲基双丙烯酰胺（贮存液）

       16．分离胶缓冲液（贮液）:1.5mol/ L ,pH8.8 Tris - HCL （含0.24%TEMED)。

       17.浓缩胶缓冲液（贮液）:0.5mol/ L ,pH6.8 Tris - HCL （含0.48%TEMED)。

       18.电极缓冲液：50mmol/ L ,pH8.5 Tris -38.4mmol/ L 甘氨酸。

       19.电泳样品溶解液：50mmol/ L ,pH7.5 Tris - HCL（含10％甘油，0.02％溴酚蓝）。

       20.0.05％考马斯亮蓝 R -250（含20％水杨酸），电泳谱蛋白染色用。

       21.0.20%NBT-0.01％核黄素溶液（避光4℃保存，6周内稳定）。

       器材

       1.新鲜鸭血

       2.冰浴

       3.大型冷冻离心机

       4.电动搅拌器

       5.抽滤和虹吸装置

       6.恒温水浴

       7.层析柱（1.6cm×30cm,1.6cm×100cm)

       8.冷柜

       9.层析系统（紫外检测器、记录仪、自动收集器和梯度混合器）

       10.秒表

       11.冷冻干燥器

       12.紫外可见分光光度计

       13.电泳系统：垂直板电泳槽，直流稳压电源（电压300~600V，电流50~100mA)。

       14.微量注射器（10~20uL)

       15.15W日光灯

       16.照相机