过氧化物酶的制备及活力测定

       过氧化物酶（HRP）的制备

       1.水提取：称取5kg用水冲刷干净的鲜辣根（辣根皮中亦含有丰富的 HRP )，用菜刀切成小碎块，在绞肉机中绞碎1~2次。碎渣浆用1倍体积的水在低温下搅拌提取过夜（亦可采用高速抽提法）。次日用甩干机（或离心机）甩干，收集滤液，碎渣再用 14 倍体积水浸泡提取1次，合并2次滤液，测量总体积。

       2．硫酸铵分级分离：在不断搅拌下，每1000mL滤液中慢慢加入226g硫酸铵粉末（相当于0.40饱和度，0℃)，大约在1~2小时内加完，置冷室中放置过夜。次日将上清液小心地用虹吸管移出，下面混浊液以300Or/ min 离心15分钟，弃沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸铵粉末（0.8饱和度）边加边搅拌，当硫酸铵全部溶解后，置冷室过夜。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰冻离心机中以13000r/ min 离心20分钟，弃去上清液，收集沉淀。将沉淀悬浮于100~150mL蒸馏水中（加水量要使沉淀全部溶解为止），分装于透析袋内，放在流动自来水中进行透析1~2天，直到硫酸铵透析完毕为止（可用5％乙酸钡溶液或奈氏试剂进行检查）。然后改换成用蒸馏水透析，中间更换2~3次，用0. 1mol / L
AgNO3溶液检查透析外液无氯离子为止。将透析液合并，在冰冻离心机中以4000r/ min 离心15分钟，弃去沉淀，量上清液的体积。

       3．C3H6O分级分离：将上清液倒入烧杯并置冰浴中，在不断搅拌下，用细滴管沿着杯壁缓缓加入1倍体积预冷至-15℃的C3H6O，放置片刻，在冰冻离心机中以4000r/ min 离心15分钟，弃去沉淀。上清液再加入0.8体积（按原上清液体积）-15℃C3H6O，（操作同上），静置后，在冰冻离心机中离心收集沉淀。将沉淀溶于少量蒸馏水中，透析除去C3H6O。可得RZ值近于1的酶溶液。

       4．精制：将上步酶液适当稀释，滴加1mol / L 硫酸锌溶液，使酶液中锌离子浓度为10-1 mol / L ,5000r/ min 离心10分钟，得上清液。再将沉淀用少量蒸馏水洗涤，离心，洗液与清液合并，分装于透析袋内，兑水透析除盐，用微孔滤膜过滤，进行真空冰冻干燥（约得20mg)，产品呈米黄色纤维状松软物，HRP产品的 RZ 值可达3.0左右，置真空干燥器中低温保存。

       二、过氧化物酶（HRP）的活力测定

          过氧化物酶（POD）是生物体内一类含血红素的氧化酶，广泛存在于各种动物、植物和微生物体 内，能够催化由过氧化氢参与的多种氧化反应，并且与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等多种生 理生化过程密切相关，在细胞代谢的氧化还原过程中起重要作用。 过氧化物酶可催化 H2O2 氧化愈创木酚生成茶褐色 4-邻甲氧基苯酚，产物在 470 nm 处具有特征 吸收峰，通过吸光值变化即可表征过氧化物酶的活性。

         测定过程中所需要的仪器和试剂：可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿（光径 10 mm）、研钵/匀 浆器、可调式移液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱和蒸馏水。

         注意事项

        ①若测定样本较多，可将试剂一、试剂二和试剂三按比例配成检测工作液（现用现配），37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）预热10 min以上，测定时加入50 μL粗酶液和950 μL检测工作液；

         ②准确在相应时间点完成吸光值测定，以确保实验结果的准确性和重复性；

         ③若ΔA小于0.005，可适当延长反应时间（3-5 min）后再进行测定；若ΔA大于0.5，建议将粗酶液使用提取液稀释后再进行测定，计算时相应修改；