碱性磷酸酯酶的制备和活性检测

        一、碱性磷酸酯酶的制备

        1.大肠杆菌的培养：菌种——E .coliK12（菌号1.630)。斜面培养基：1％蛋白胨，0.5％氯化钠，2％琼脂，0.5％牛肉膏溶液，pH7.0~7.2。种子及发酵液体培养基：0.08mol/ L 氯化钠，0.02mol/ L 氯化钾，0.02mol/ L 氯化铵，0.001mol/ L 氯化镁，2X10-4mol / L 氯化钙，4X10-6mol / L 氯化锌，2X10-6mol/ L 三氯化铁，1.4X10-4mol/ L β﹣甘油磷酸钠，5×10-4mol/ L 硫酸钠，1.2X10-2mol/ L 葡萄糖。5X10-2mol/ L 三乙醇胺，0.5％蛋白胨（含磷浓度0.1%)。加水到1000mL，用稀盐酸调 pH 至7.4。

        培养的流程为：菌种→斜面（37℃，活化）→种子液（37℃,10~12小时）→发酵液。在37℃，于500mL锥形瓶中盛100mL发酵培养液，按5%~10％量进行接种，用往返式摇床，通气培荞20小时。大肠杆菌碱性磷酸酯酶产生于对数生长期的后期。并在对数生长期后期的一段时间内，保持酶的活力无大的变化。经实验测定，停止发酵时间在菌龄16~24小时为宜。

        培养完毕后，将发酵液于4000r/ min 离心10分钟，收集菌体，用预冷的0.01mol/ L , pH7.7Tris- HCl缓冲液洗涤菌体3次。每1000mL发酵液可得湿菌体2g左右。

2. 菌体的破碎：每g湿菌体中按20mL的比例加入0.0005mol/ LEDTA -0.5mol/ L 蔗糖﹣0.03mol／L，pH8.0Tris- HCl 缓冲液，于23℃振荡高渗处理10分钟。于13000r/ min 离心10分种，收集沉淀。然后按20mL/ g 湿菌体的比例加3℃预冷蒸馏水于菌体沉淀中，在3℃振荡10分钟，使菌体膨胀，酶被释放。于冰冻离心机中以13000r/ min 离心20分钟，弃沉淀物，得到酶的粗提取液。留样测活。
3. 热处理：用1/10体积的0. 1mol / L 氯化镁﹣0. 1mol / L ,pH7.4Tris- HCl 缓冲液，调整粗提取液，使Mg2+及缓冲液的最终浓度均为0.01mol/ L 。然后在80℃（内温）加热15分钟，过滤或离心除去变性蛋白后，收集滤液。
4. 硫酸铵盐析：在电磁搅拌下，向酶液中慢慢加入硫酸铵粉末，使达0.85~0.90饱和度（559~603g/L，0℃），置冰箱过夜。次日于13000r/min离心20分钟，收集沉淀。用1/50体积的0.001mol/L氯化镁-0.01mol/L，pH7.4Tris-HCL缓冲液溶解沉淀，然后对0.001mol/L氯化镁-0.01mol/L，pH7.4Tris-HCL缓冲液透析，用奈氏试剂检查直到除尽铵离子为止。留样测活。
5. DEAE-纤维素柱层析：根据酶液的蛋白质含量选择合适的柱。将DEAE-纤维素（DEAE-C11）处理后装柱，用0.001mol/L硫酸镁-0.01mol，pH7.4Tris-HCL缓冲液平衡，然后将酶样品上柱，进行线性梯度洗脱，储液瓶盛0.001mol/L硫酸镁-0.3mol/L氯化钠-0.01mol/L，pH7.4Tris-HCL缓冲液，混合瓶盛0.001mol/L硫酸镁-0.01mol/L，pH7.4Tris-HCL缓冲液。控制流速1mL/min，3~5mL/管，部分收集器收集，280nm处检测。一般洗脱液体积相当于柱体积的6倍。根据柱层析图谱、测定酶活力，活性峰出现时洗脱液的盐浓度约在0.12mol/L。将具有酶活性的收集管经过测定杂酶，然后适当合并，用Sephadex柱浓缩，将酶液分装于小试管，置低温冰箱冰冻保存。

        二、碱性磷酸酯酶的活力测定

        1.碱性磷酸酶在碱性环境中能够催化磷酸苯二钠生成游离酚，酚与 4-氨基安替比林和铁氰化钾反 应生成红色亚醌衍生物，产物在 510 nm 处具有特征吸收峰，通过吸光值增加速率即可表征碱性磷酸酶的活性。

        2.测定过程中所需要的仪器和试剂：可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、可调式移 液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱和蒸馏水。