超氧化物歧化酶（SOD）的制备和活力测定

        超氧化物歧化酶（superoxide dismutase , SOD)，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由基清除剂，具有抗氧化、抗衰老、抗辐射和消炎作用，也是目前为止发现的唯一以自由基为底物的酶。超氧化物歧化酶按其所含金属辅基不同可分为三种：第一种是含铜与锌超氧化物歧化酶（ Cu · Zn - SOD )，最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第二种是含锰超氧化物歧化酶（Mn - SOD )，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内；第三种是含铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD )，呈黄褐色，存在于原核细胞中。超氧化物歧化酶可催化超氧负离子（O- 2）进行歧化反应，生成氧和过氧化氢：20- 2+H2=O2+ H2O2。大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有丰富的SOD，通过组织或细胞破碎后，可用pH 7.8的磷酸缓冲液提取。由于SOD不溶于丙酮，可用丙酮将其沉淀析出。

        SOD酶的活力单位定义为可抑制50％肾上腺素自氧化所需的酶量。

         超氧化物歧化酶制备

        1.组织或细胞破碎

        称取5~10g大蒜蒜瓣，置于研钵中冰浴下充分研磨，使组织或细胞破碎。

        2.SOD的提取 将上述破碎的组织细胞，加入2~3倍体积预冷的0.05mol/ L pH 7.8磷酸缓冲液，继续研磨搅拌20min，使SOD充分溶解到缓冲液中，于4℃、5000r/min离心15min。弃沉淀，得上清提取液。

        3.去杂蛋白 取5ml上述提取液，加入2.5倍体积的氯仿﹣乙醇混合溶剂，搅拌15min，于4℃、5000r/min离心15min。去除杂蛋白沉淀，得上清粗酶液。

        实验器材

        1.新鲜蒜瓣（或培养的大蒜细胞）       

        2.恒温水浴锅

        3.研钵                    

        4.吸管5.0ml（×5）、10ml（×1）、0.5ml（×3）

        5.电子天平                

        6.试管1.5cm×15cm

        7.冷冻离心机

        实验试剂

        1.0.05mol/ L 磷酸缓冲液（pH 7.8)：用0.05mol/ L Na2HPO4和0.05mol/LNaH2PO4以体积比91.5:8.5混合即可。

        2．氯仿﹣乙醇混合溶剂：V（氯仿）: V（无水乙醇）=3:5。

        3．丙酮。

        4.0.05mol/ L 碳酸盐缓冲液（pH 10.2)：用0.05mol/ L Na2CO3 和0.05mol/ L NaHCO3以体积比6:4混合即可。

        5.0.1mol/ LEDTA 溶液。

        6．盐酸肾上腺素注射液。

        7．肾上腺素溶液（2mmol/ L )：取上述盐酸肾上腺素注射液1ml加1.33ml蒸馏水即得。

        超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（AKAO001）

            黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统能够产生超氧阴离子（O₂^-），O₂^-可还原氮蓝四唑生成蓝色甲臜，产物在560 nm处具有特征吸收峰；SOD可清除O₂^-，从而抑制甲臜的形成，反应液颜色越深，表明SOD活性愈低，反之活性越高，通过吸光值的变化即可表征超氧化物歧化酶的活性。

            测定过程中所需要的仪器和试剂：可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿（光径 10 mm）、研钵/匀 浆器、可调式移液器、台式离心机、恒温水浴/培养箱和蒸馏水。

        注意事项

        ①粗酶液和试剂二在测定过程中应置于冰上放置，以免造成变性或失活；

        ②若测定样本较多时，可将试剂一、试剂二和试剂三按表格中比例配制作为检测工作液，试剂五 必须最后加入；